Immunity | scRNA-Seq揭示炎症性皮肤病的细胞状态和分子特征

美国麻省理工学院的研究团队基于前期开发的Seq-Well技术，提高对细胞中低拷贝的转录因子、细胞因子与细胞因子受体的检测灵敏度，开发出Seq-Well S³单细胞检测技术。利用该技术，研究人员绘制了5种人类皮肤炎症性疾病的单细胞转录图谱。该文章在2020年10月发表于Immunity，以下是文章的详细解读。

文章题目：Second-Strand Synthesis-Based Massively Parallel scRNA-Seq Reveals Cellular States and Molecular Features of Human Inflammatory Skin Pathologies

发表时间：2020-10-13

发表期刊：Immunity

主要研究团队：美国麻省理工学院等

影响因子：22.553

DOI：10.1016/j.immuni.2020.09.015

研究背景

scRNA-seq能够在单细胞水平上研究基因的表达模式，从而深入了解细胞异质性，但与低通量方法相比，高通量scRNA-seq方法从每个细胞中回收的信息较少。因此，想要准确检测细胞中低拷贝数mRNA的表达，需要高保真和高通量的scRNA-seq平台。为了满足这一需求，研究人员研发了Seq-Well S³（第二链合成）大规模并行scRNA-seq技术。该技术使用随机引发的第二链合成来确保逆转录过程的成功进行。与Seq-Well相比，Seq-Well S³的转录捕获和基因检测效率分别提高了10倍、5倍。为了说明Seq-Well S³的实用性，研究人员用该技术来构建人类正常皮肤与5种炎症性皮肤病，包括痤疮、斑秃、环状肉芽肿、麻风病和牛皮癣的皮肤组织细胞转录图谱，揭示出不同病理条件下不同细胞亚群丰度和表型的变化，为了解皮肤炎症性疾病的发生、发展机制提供了宝贵的资源。

研究策略

研究人员收集人类痤疮（n=4）、斑秃（n=1）、环状肉芽肿（n=2）、麻风病（n=4）、牛皮癣（n=5），以及正常对照（n=3）皮肤组织多个生物学重复样本，使用Seq-Well S³技术对样本进行分析，得到38,274个单细胞转录组，并聚类为35个细胞簇，构建了5种皮肤炎症性疾病的单细胞转录图谱。为了研究不同病理条件下细胞丰度和表型的变化，研究人员对T细胞、髓系细胞、间质细胞和角质细胞进行了重聚类分析。并通过分析不同细胞亚群的细胞丰度变化，探讨了不同炎症性疾病之间的异同特征，例如，麻风病和环状肉芽肿中都出现相似的炎性T细胞；也发现了疾病独有的特征，在牛皮癣患者的细胞中发现角质细胞所表达的基因能够驱动炎症的出现。最后，通过对角质细胞的拟时序分析，研究人员研究了角质细胞变化驱动炎症发展的机制。

研究成果

1. Seq-Well S³技术提高了转录本捕获率与基因检测率

在逆转录过程中“模板切换”步骤会限制现有的scRNA-seq方法（如Seq-Well和Drop-Seq）对低拷贝数mRNA的捕获率。因此，研究人员在第一链cDNA构建后加入了随机引发的第二链合成（图1A）。在逆转录后，研究人员用0.1 mol NaOH清洗带条形码的mRNA捕获珠以去除附着的RNA模板链，然后进行随机引发的第二链合成，以生成在一端用SMART标记的双链cDNA序列及其反向补码。

研究人员同时使用Seq-Well S³和10X v3技术对人PBMC样本进行建库，比较分析发现，Seq-Well S³对转录因子、细胞因子和细胞因子受体等重要调控因子具有更高的检出率和灵敏性（图1B、C）。

图1 Seq-Well S³技术原理与优势展示

2. 健康和炎症性皮肤的单细胞转录图谱

研究人员将Seq-Well S³应用于分析正常健康皮肤和炎性皮肤（痤疮、斑秃、环状肉芽肿、麻风病和牛皮癣）组织样本。在过滤低质量细胞后，获得38,274个高质量的单细胞转录组。使用Scanpy中的Louvain聚类，识别了35个簇（图2A~C）。通过细胞类型特征基因分析，研究人员确定了15个不同细胞类型，包括B细胞、成纤维细胞、毛囊、角质形成细胞、朗格汉斯细胞、淋巴管内皮细胞细胞、肥大细胞、黑素细胞、髓系细胞、浆细胞、雪旺细胞、皮脂腺细胞、T细胞、静脉内皮细胞和血管平滑肌细胞。

图2 Seq-Well S³构建的5种炎症性皮肤病的单细胞转录图谱

3. 炎症性皮肤的T细胞状态

研究人员首先对T细胞进行降维和聚类，识别出自然杀伤（natural killer，NK）细胞、 CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T 辅助（T helper，Th）细胞亚群等9个细胞亚群（图3A、B）。接下来，研究人员分析不同病理条件下T细胞亚群组成的变异性，观察到Th-17亚群在麻风病样本中富集。在牛皮癣样本中，表达NR4A1并富含参与核组织的基因（NEAT和ANKRD36）的T细胞亚群富集（图3B、C）。此外，研究人员还观察到5名牛皮癣患者中有3个调节性T细胞扩增（图3A~D）。

TCR表达谱分析对于了解T细胞抗原特异性至关重要。从外周血获得的CD4⁺ T细胞中，在皮肤炎症的情况下，研究人员在53.5%的T细胞中检测到TRAC，在76.7% T细胞中检测到TRBC，在45.1% T细胞中均能检测到二者（图3E）。在具有至少25,000个reads的T细胞中，研究人员检测到68.6%的T细胞表达α和β型TCR基因；在细胞毒性细胞中，研究人员观察到γ和δ型基因（TRGC和TRDC）的表达，而其余的T细胞簇仅表达α和β TCR基因。这些数据进一步表明，γδ、NK和细胞毒性CD8⁺ T细胞具有共同的基因表达特征，可能在炎症中发挥作用。最后，研究人员检测了TCR V基因表达在炎症性皮肤活检中的表达分布，发现在包括麻风病和痤疮在内的多个活检样品中，TRAV和TRBV基因的偏倚分布（图3F）。

图3 使用Seq-Well S³技术识别炎症性皮肤条件下的不同T细胞亚群

4. 皮肤炎症中髓系细胞状态谱

接着，研究人员对5,010个髓系细胞进行了降维和聚类，识别出包含树突状细胞（dendritic cells，DCs）、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和肥大细胞的细胞亚群（图4A~E）。研究人员重点对树突状细胞进行了分析，确定了5个不同的细胞亚群：已知的cDC1（表达CLEC9A、IRF8和WDFY4）、cDC2（表达IRF4、SOCS2、SLCO5A1、CD1B和CD1E）和3种真皮DCs细胞亚群（图4F、G）。来自真皮DC 1亚群的细胞显示，IL1R1、IL1R2、CCR7，以及包括FCER1A、FCGR2A和FCGR2B 在内的Fc受体的表达升高，这些基因对体液免疫的调控很重要。在真皮DC2亚群中，研究人员观察到组织蛋白酶（CTSL和CTSB）和表面受体（CD300E和 SLC11A1）的表达升高，它们共同代表DC激活的标志物。最后，真皮DC3亚群在DC成熟过程中，促炎趋化因子（CCL3、CCL4和CCL5）和可溶性介质（EREG和INHBA）的表达升高。

图4 Seq-Well S³技术识别炎症性皮肤条件下不同髓系细胞亚群

5. 皮肤炎症中间质细胞状态谱

研究人员确定了3个由不同表达模式定义的真皮静脉内皮细胞（venular endothelial cells，ECs）亚群（图5A~C）：VSMCs（TAGLN）、ECs（CD93）和淋巴ECs（LYVE1）。同时，研究人员在正常和炎症性的皮肤样本中发现多个CD93⁺ EC亚群（图5A、B）。例如，观察到一组CD93⁺ ECs（小静脉亚群3）显示SLC9A3R2的表达升高，这与内皮稳态有关（图5D）。在毛细血管后的小静脉中，研究人员发现ITGA5、ITGA6、ICAM2和ITGA2的表达升高，而VSMC则趋向于高表达ITGA7、ITGA8和ITGB5。此外，研究人员还观察到ITGB4、ITGB8和ITGA9在淋巴EC中表达最高（图5E）。

与炎症性组织相比，来自正常皮肤的成纤维细胞在LTBP4、IGFBP5和TCF4（成纤维细胞簇2和8）中显示出富集。与之前对真皮成纤维细胞的单细胞研究一致。在之前对真皮成纤维细胞的单细胞研究中，研究人员观察到表达COL11A1、DPEP1和RBP4并被认为在结缔组织分化中起作用的成纤维细胞亚群（成纤维细胞簇3）（图5H）。在环状肉芽肿样本中，研究人员观察到2个不同的成纤维细胞群。来自环状肉芽肿患者1（亚群0）的成纤维细胞显示蛋白酶抑制剂16（PI16）的表达升高，它抑制MMP2和ITIH5（一种对维持在皮肤炎症中过度表达的皮肤透明质酸很重要的蛋白酶抑制剂）的功能（图5H、I）。同时，来自环状肉芽肿患者2（亚组7）的成纤维细胞表达SPOCK1、CRLF1和 COMP。此外，研究人员还在麻风病感染样本中观察到不同的成纤维细胞表型（图5I）。最后，在所有5例牛皮鲜样本中，研究人员观察到一组促炎成纤维细胞（成纤维细胞簇4）富集，其特征是CCL19、TNFSF13B （BAFF）和CXCL12的表达升高。

图5 使用Seq-Well S³技术识别炎症性皮肤条件下不同间充质细胞亚群

6. 皮肤炎症下角质细胞的分化轨迹

在表皮层，角质细胞（keratinocytes，KCs）经过一系列分化过程从而达到成熟状态（图6A）。通过拟时序分析，研究人员构建了正常皮肤组织和炎症性皮肤组织的角KCs分化图谱（图6B、C）。通过相关分析与差异表达分析，研究人员发现了一系列特异性参与炎症性皮肤条件下角质细胞分化的调节因子，如IL-17、FOSL1等（图6D~I）。

图6 角质细胞的分化轨迹

结论

研究人员开发出高通量Seq-Well S³测序技术，并构建了人类5种炎症性皮肤病的单细胞转录图谱；通过对不同细胞类型的重聚类分析，建立了多种不同类型细胞的细胞亚群图谱，同时揭示了它们在不同疾病中的丰度。

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